John, le père de Dean et Sam, est un ancien soldat de l'armée Américaine, qui a dû élever seul ses garçons après le meurtre de sa femme. Il n'aura dès lors plus qu'un unique but, celui de retrouver et de tuer la créature surnaturelle qui a bouleversée sa vie, et ce, au détriment de l'éducation de ses fils. Il les entraîne sur les routes avec lui, et les élève comme des soldats, en leur apprennant tout ce qu'il découvre sur le surnaturel.

C'est à cause de sa disparition que Dean et Sam sont amenés à repartir sur les routes ensemble. Grâce à son journal, qui réunit toutes les informations qu'il a pu accumuler sur le surnaturel pendant les 20 dernières années, les frères Winchester ont pu résoudre de nombreuses affaires.

Lorsque ses fils retournent dans la maison de leur enfance, Dean laisse un message sur son répondeur. John les rejoind, mais préfére ne pas dévoiler sa présence à ses deux enfants. Il reste donc caché chez une de ses amies voyante, Missouri Moseley. Plus tard, John rend enfin visite à des deux fils à Chicago. Meg, une femme possédée par un des enfants du démon qui a tué sa femme, leur dévoile que le démon poursuit John. Après avoir vaincu le Daeva, John préfére partir seul pour ne pas mettre en danger ses fils. Ils se retrouvent donc une nouvelle fois séparés. Mais, John revoit Dean et Sam quand ceux-ci enquêtent sur la mort d'un viel ami de John, Daniels Elkins, un tueur de vampire, tué car il possèdait le Colt, la célèbre arme capable de tuer n'importe quelle créature. Les trois hommes arrivent à reprendre le Colt et décident ensuite de combattre le démon aux yeux jaunes ensembles. Quand Meg menace de tuer tous leurs amis afin de récupérer le Colt, John le retrouve et lui donne un faux pistolet. Il est alors capturé et tourturé. Les frères Winchester viennent à son secours mais ils se rendent compte que leur père est possédé par leur pire ennemi, le démon aux yeux jaunes. Sam tire sur son père à la jambe, espérant ainsi le libérer de l'emprise du démon. Une fois libéré, les Winchester prennent la voiture de Dean, mais un homme possédé par le démon les percute avec un camion.


Après l'accident, Sam et John se réveillent à l'hopital avec des blessures mineures, tandis que Dean oscille entre la vie et la mort. John demande à Sam de lui apporter du matériel pour convoquer le démon dans l'hopital où ils se retrouvent ensuite. Il semble qu'il sait quels projets le démon a pour Sam et les autres enfants. Il fait donc un pacte avec le démon pour que Dean reste en vie. En retour, il se sacrifie et donne le Colt ainsi que la dernière balle. Après que Dean se soit enfin réveillé, Sam retourne voir son père pour lui demander où il était la nuit d'avant. John va ensuite lui demander d'aller lui chercher un café. Un fois Sam partit, il va voir Dean et lui demance de prendre soin de Sam. Puis il lui chuchote quelque chose à l'oreille. Il retourne ensuite dans sa chambre d'hopital et donne le Colt à quelqu'un. Sam revient, et trouve son père allongé sur le sol, inconscient. Le docteur arrive pour tenter de le réanimer mais il est déjà trop tard. L'heure officielle du décès de John Winchester fut déclarée à 10h41 du matin. Dans un autre épisode "Crossraods" Dean apprend par un démon que son père a vendu son âme au diable pour le sauver. Encore un peu plus tard, Sam est possédé par le démon Meg, et dit à Dean que son père est en Enfer. On revoit John dans l'épisode intitulé "All Hell Breakes Loose, Part 2" quand les portes de l'Enfer sont ouvertes. Quand le démon aux yeux jaunes s'apprête à tuer Dean, l'âme de John agrippe le démon. Cela donne le temps à Dean de reprendre le Colt et de tirer dans le coeur du démon. John fait un sourire paternel à ses deux fils avant de disparaître dans une lumière éclantante. Son âme repose enfin en paix.